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Caracterização estrutural de ácidos gordos, em particular intermediários da biohidrogenação, por cromatografia gasosa acoplada á espetrometria de massa

 

Susana Alves

(Laboratório de Metabolismo Lipídico de Ruminantes - CIISA-FMV)

 

 

1. Análise de ácidos gordos por cromatografia gasosa

 

A cromatografia gás-liquido (GLC, do inglês “gas-liquid chromatography”) é uma técnica vulgarmente utilizada para a separação de misturas de compostos voláteis. Esta técnica rege-se pelo princípio da partição dos componentes de uma mistura entre duas fases diferentes, uma fase gasosa móvel (gás inerte) e uma fase estacionária, liquida. A amostra, depois de introduzida em uma câmara aquecida (injetor), é imediatamente vaporizada e à medida que a fase móvel atravessa a coluna, os componentes da amostra são continuamente repartidos entre as duas fases. Os que apresentam uma maior afinidade com a fase móvel movem-se de forma mais rápida através da coluna, enquanto aqueles que apresentam uma forte atração para a fase estacionária migram mais devagar, ocorrendo a separação.

A deteção de cada um dos componentes pode ser obtida através de diversos tipos de detetores, no entanto o detetor de ionização de chama (conhecido pela sigla FID, do inglês “flame ionization detector”) é o mais frequentemente utilizado para a análise de compostos carbonados incluindo ácidos gordos. A sua utilização baseia-se na medição da variação da corrente de ionização da chama de hidrogénio/ar na presença das substâncias eluídas. A magnitude do sinal de ionização é proporcional ao número de átomos de carbono ionizáveis (Grob, 1995). Na Figura 1 é apresentada uma representação esquemática dos componentes fundamentais de um cromatógrafo gás-liquido com deteção por FID utilizando-se uma coluna capilar e hélio como gás de arraste.

 

Cromatografo

Figura 1 – Componentes fundamentais de um cromatógrafo gás-liquido, composto por: hélio como gás de arraste acoplado a um sistema de controlo do fluxo gasoso; um sistema de injeção da amostra a alta temperatura de modo a vaporizar a amostra; um forno contendo uma coluna capilar de dimensão variável e programável para funcionar a temperatura constante ou com programação de temperatura; um detetor de ionização de chama; e um registador de dados (computador).

 

Os ácidos gordos são vulgarmente analisados sob a forma de ésteres metílicos (FAME, do inglês “fatty acid methyl esters”), uma vez que apresentam a vantagem de possuírem boas propriedades cromatográficas e serem mais voláteis que os ácidos gordos livres (Eder, 1995). Além disso a sua preparação em laboratório é bastante acessível e rápida (Christie, 1989). Para a análise dos FAME por GLC, diferentes tipos de colunas capilares com diferentes tipos de fases estacionárias, de moderada a altamente polares, podem ser utilizadas, no entanto dependendo do tipo de fase estacionária ocorrerá uma melhor ou pior separação de todos os ácidos gordos da amostra. A Figura 2 ilustra dois cromatogramas de uma amostra de carne de ovino utilizando duas colunas de fases estacionárias diferentes. As colunas com fase estacionária altamente polar são amplamente utilizadas para a análise de amostras contendo misturas complexas de isómeros geométricos e posicionais, particularmente apresentam uma especial capacidade de separação dos isómeros 18:1 com configurações cis e trans.  

 

figura 2

Figura 2 – Análise de uma amostra de carne de borrego por cromatografia gasosa com deteção por ionização de chama utilizando uma coluna de 30-m, moderadamente polar (Omegawax 250), ou de 100-m, altamente polar (CP-Sil88).

 

A identificação dos ácidos gordos por GLC-FID baseia-se na comparação dos tempos de retenção de cada ácido gordo com padrões puros individuais ou por comparação com cromatogramas publicados na literatura. A sua quantificação é geralmente efetuada através das áreas dos picos, e as concentrações absolutas podem ser determinadas pela adição de um padrão interno, geralmente um ácido gordo que não exista na amostra ou cuja abundancia seja minoritária. Algumas revisões importantes sobre a análise de ácidos gordos por cromatografia gasosa foram publicadas por Eder (1995), Ackman (2002) e Christie (1989). 

Previamente à análise dos ácidos gordos por GLC poderá ser necessário fracionar ou purificar as amostras de modo e evitar que alguns compostos co-eluam durante a análise cromatográfica. A purificação poderá ser importante, por exemplo, durante a análise da composição em ácidos gordos de forragens verdes, pois foi demonstrado por nós que este tipo de matriz produz alguns produtos secundários que interferem com a análise dos ácidos gordos (Alves et al., 2008). Algumas matrizes de origem animal, especialmente provenientes de ruminantes, contêm perfis em ácidos gordos bastante complexos, sendo por isso essencial muitas vezes fracionar os ácidos gordos em: saturados, mono-insaturados com configurações cis e trans, poli-insaturados e também em ácidos gordos conjugados. Para este tipo de fracionamento utiliza-se a cromatografia com iões de prata nas suas diversas formas, nomeadamente a cromatografia em camada fina (Ag+-TLC), cromatografia líquida de alta eficiência (Ag+-HPLC) ou a extração em fase sólida (Ag+-SPE) (Juaneda et al., 1994; Kramer et al., 1998; Buchgraber and Ulberth, 2001; Delmonte et al., 2004; Kramer et al., 2008). Apesar destes fracionamentos, a caracterização e identificação inequívoca dos ácidos gordos por GLC-FID não é possível, pois esta técnica não nos dá informação estrutural dos ácidos gordos o que torna a análise de matrizes complexas bastante incompleta ou muitas vezes errada. No entanto a GLC acoplada a equipamentos de espectrometria de massa pode ser bastante útil nestes casos.

 

 

2. Análise da composição em ácidos gordos por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa

 

A cromatografia gasosa com deteção por espectrometria de massa (GC-MS, do inglês, “gas-chromatography mass spectrometry”) é uma ferramenta poderosa pois possibilita elucidar a estrutura de um composto desconhecido. De facto, desde os anos 60 que esta ferramenta é utilizada para análise estrutural de ácidos gordos (Ryhage and Stenhagen, 1960; O'Connor, 1964; Kleiman and Spencer, 1973).

Durante a análise por GC-MS, os ácidos gordos sob a forma de esteres metílicos são inicialmente separados cromatograficamente, de seguida chegam ao espectrómetro de massa, onde são introduzidos num sistema de vácuo em que as moléculas são excitadas através do fornecimento de energia (bombardeamento por um feixe de eletrões). Após a excitação, a procura das moléculas por melhor estabilidade leva à quebra das ligações formando-se iões mais pequenos como fragmentos da molécula original. A formação dos fragmentos iónicos implica assim o fornecimento de energia à molécula original. Os métodos mais correntes de ionização são por impacto de eletrões (EI, do inglês, “electron impact”) ou por ionização química (CI, do inglês, “chemical ionization”). Os fragmentos iónicos gerados após ionização podem ser separados de acordo com a sua relação massa/carga (m/z) dando origem a um padrão definido, espetro de massa, que contém informação única e característica de cada ácido gordo (Neves e Freitas, 1996). A separação de iões de acordo com a sua relação massa/carga pode ser baseada em diferentes princípios dependendo do tipo de analisador, por exemplo, do tipo quadrupolo, “ion trap”, setor magnético, setor elétrico, ou tempo de voo (Hoffman and Stroobant, 2007).

Apesar da poderosa capacidade da espectrometria de massa de permitir caracterizar a estrutura dos ácidos gordos, muitas vezes a identificação e localização de alguns grupos funcionais e a posição das duplas ligações poderá não ser tão simples. De facto, a localização da posição das duplas ligações dos ácidos gordos é a mais desafiante e importante em estudos de metabolismo lipídico.

Os espectros de massa dos ácidos gordos sob a forma de ésteres metílicos obtidos por ionização EI dão-nos informação sobre o comprimento da cadeia alifática e o grau de insaturação. No entanto, a localização das duplas ligações não pode ser determinada com precisão, bem como a sua geometria, uma vez que isómeros posicionais e geométricos de ácidos gordos de igual cadeia alifática, apresentam espectros de massa bastante idênticos. Na verdade, as duplas ligações, sob ionização por EI, migram ao logo da cadeia, portanto, a sua posição original não pode ser determinada com certeza (Murphy, 1993; Spitzer, 1996; Christie, 1998a,b). De modo a ultrapassar estes problemas, foram desenvolvidos diversos métodos para determinação da posição das duplas ligações. Estes poderão envolver, ou a) derivatização das duplas ligações ou do grupo carboxílico seguida de análise dos produtos por espectrometria de massa (Spitzer, 1996Christie, 1998a,b); ou b) requerer a utilização de técnicas de espectrometria de massa com fontes de ionização específicas (Van Pelt et al., 1999a,b; Michaud et al., 2002).

Os métodos de derivatização das duplas ligações poderão ser úteis na análise de ácidos gordos mono-insaturados, mas particularmente difíceis em ácidos gordos contendo um grande número de duplas ligações. Em particular, em produtos de ruminantes, que são naturalmente ricos em ácidos gordos com múltiplas duplas ligações de configuração cis e trans. Estes derivam da extensa isomerização e hidrogenação dos lípidos da dieta que tem lugar no rúmen - intermediários da biohidrogenação. Os métodos mais comuns para caracterização dos intermediários da biohidrogenação são a derivatização do grupo carboxílico em derivados contendo azoto, ou a aplicação de técnicas hifenadas com fontes de ionização específicas. A Tabela 1 resume os diferentes derivados de ácidos gordos e técnicas utilizadas para análise dos intermediários da biohidrogenação. Estes métodos serão apresentados posteriormente.

Tabela 1 - Resumo dos derivados e técnicas de espetrometria de massa utilizadas para determinação da posição das duplas ligações de ácidos gordos insaturados.

Derivados dos ácidos gordos

Técnica

Referência

Ésteres metílicos

GC-MS/MS

Tipo de ionização: CI

 

Van Pelt et al., 1999a,b

Michaud et al., 2002

Lawrence and Brenna, 2006

4,4-dimetiloxazolinas (DMOX)

GC-MS,

Tipo de ionização: EI

Fay and Richli, 1991

Luthria and Sprecher, 1993

Christie et al., 2000

Hamilton and Christie, 2000

Pirrolidinas

GC-MS

Tipo de ionização: EI

Andersson et al., 1975

Christie et al., 1986

Picolinilos

GC-MS

Tipo de ionização: EI

Christie et al., 1987a,b

Christie et al., 1988

Christie, 1998a

 

 

 

2.1. Determinação da posição das duplas ligações dos ácidos gordos através de métodos de derivatização

 

Comparativamente com os ésteres metílicos, a derivatização do grupo carboxílico dos ácidos gordos em derivados contendo azoto, ex. pirrolidinas, picolinilos ou dimetiloxazolinas (Figura 3), torna-os mais uteis na determinação da posição das duplas ligações apenas pela análise dos seus espetros de EI. A vantagem destes derivados é que por conterem átomos de N, o radical amida transporta a carga quando a molécula é ionizada em vez de esta migrar ao longo da cadeia alquilica, conduzindo à formação de espectros de massa que geralmente são simples de interpretar (Dobson and Christie, 2002).

 

 Figura 3

Figura 3 – Exemplos de derivados de ácidos gordos utilizados para localização da posição das duplas ligações por espectrometria de massa.

 

As pirolidinas foram os primeiros derivados a serem descritos para localização das duplas ligações dos ácidos gordos (Andersson et al, 1975; Andersson, 1978). No entanto, apesar do seu potencial, a sua utilização tem sido negligenciada. Já os derivados dimetiloxazolina (DMOX) e picolinilos têm sido utilizados com mais frequência. Cada um deles tem vantagens para determinados tipos de ácidos gordos pelo que são considerados como complementares e deverão ser utilizados conjuntamente (Christie, 1998). Importantes revisões sobre os derivados DMOX e picolinilos foram publicadas por Spitzer (1996) e Harvey (1992), respetivamente. Além disso, William Christie e seus colaboradores têm estudado extensivamente ambos os derivados dos ácidos gordos e publicada online uma abrangente base de dados de espectros de massa (www.lipidlibrary.co.uk).

Nos espectros de massa de ambos os tipos de derivados, as cadeias saturadas apresentam fragmentos ou iões com diferenças regulares de 14 amu (unidade de massa atómica) devido a clivagem entre grupos metileno adjacentes. Nos ácidos gordos insaturados dos derivados DMOX, se existir uma dupla ligação entre os carbonos n e n+1, então iremos encontrar um intervalo de 12 amu (em vez de 14) entre os iões correspondentes aos fragmentos que contêm os átomos de carbono n-1 e n. Para os ésteres picolinilos a posição das duplas ligações é identificada pelo intervalo de 26 amu entre os iões correspondentes aos fragmentos n-1 e n +1. Estas regras são particularmente úteis na identificação da posição das duplas ligações dos ácidos gordos polinsaturados, no entanto, algumas exceções podem ocorrer em ácidos gordos com duplas ligações mais próximas ao grupo carbonilo. A Figura 4 ilustra o derivado DMOX do 18:1 cis-9, em que a diferença de 12 amu entre os iões de m/z 196 e 208 indicam que a dupla ligação dupla se encontra no carbono-9.

           

Figura 4 

Figura 4 – Espectro de massa obtido por impacto eletrónico do derivado DMOX do ácido gordo 18:1 cis-9. A diferença de 12 amu entre os iões de m/z 196 e 208 identifica a dupla ligação na posição 9 (espetro retirado de www.lipidlibrary.co.uk).

 

Nos estudos de metabolismo lipídico, tanto os DMOX como os picolinilos têm sido utilizados na caracterização dos intermediários da biohidrogenação do rúmen e nos tecidos, isto é, músculo e produtos lácteos (Tabela 2). Nas últimas décadas a caracterização destes intermediários têm aumentado de modo significativo, e espera-se que continue a aumentar devido ao fácil acesso a equipamentos de espectrometria de massa hoje em dia. O 18:3 cis-9,trans-11,cis-15 é um conhecido intermediário da biohidrogenação do 18:3n-3 e foi um dos primeiros intermediários a ser identificado por análise de GC-MS do derivado DMOX (Destaillats et al, 2005; Wasowska et al, 2006; Plourde et al, 2007). Posteriormente, tem sido já identificado em rúmen, carne e produtos lácteos (Akraim et al, 2007; Gomez-Cortes et al, 2009). Recentemente, a análise dos espetros de massa dos derivados DMOX dos ácidos gordos da digesta omasal de animais suplementados com óleo de peixe, permitiu a identificação de 27 novos intermediários da biohidrogenação de cadeias com 20 e 22 átomos de carbono contendo pelo menos uma ligação dupla trans (Kairenius et al, 2011). No nosso grupo, a derivatização de ácidos gordos em derivados DMOX permitiu identificar novos intermediários da biohidrogenação do ácido esteriadónico (18:4n-3, SDA) no rúmen. A caracterização destes intermediários levou à proposta de uma nova via metabólica (Alves et al, 2012).

Apesar de os derivados DMOX e picolinilos serem úteis na caracterização dos ácidos gordos, estes têm as suas limitações, por exemplo, a sua incapacidade de distinguir entre isómeros geométricos. Além disso, a sua preparação envolve o tratamento químico da amostra, o que aumenta o potencial de ocorrerem isomerizações, contaminações ou reações incompletas. Devido ao seu alto peso molecular comparado com os ésteres metílicos, estes derivados requerem temperaturas mais elevados do forno, promovendo mudanças nos tempos de eluição, o que torna difícil estabelecer uma correspondência com os ésteres metílicos. Assim, os métodos de caracterização dos ácidos gordos sob a forma de ésteres metílicos são preferíveis.

 

Tabela 2 - Trabalhos em que são caracterizados intermediários da biohidrogenação utilizando derivados DMOX.

 

Intermediário

Matriz

Referência

18:2 D5,10; D5,11; D11,15

Rúmen

Alves et al., 2012a

18:2 cis-11,cis-15

Manteiga

Nikolova et al., 2006

18:2 trans-11,trans-15

Carne

Jeronimo et al., 2011

18:2 trans-11,cis-15

Rúmen

Wasowska et al., 2006

18:3 cis-9,trans-11,cis-15

Gordura de leite

Destaillats et al., 2005

 

Gordura de leite

Gomez-Cortes et al., 2009

 

Gordura de leite

Akraim et al., 2007

 

Rúmen

Wasowska et al., 2006

 

Carne e leite

Plourde et al., 2007

18:3 cis-9,trans-11,trans-15

Gordura de leite

Gomez-Cortes et al., 2009

18:3 trans-9,trans-11,cis-15

Rúmen

Wasowska et al., 2006

18:3 cis-9,trans-13,cis-15

Gordura de leite

Destaillats et al., 2005

 

Carne

Plourde et al., 2007

18:3 D5,11,14; D5,11,15; D5,10,15

Rúmen

Alves et al., 2012a

20- a 22- átomos de carbono

Omasal digesta

Kairenius et al., 2011

 

Digesta

Toral et al., 2010

 

  

2.2.  Determinação da posição das duplas ligações dos ácidos gordos através de técnica de GC-MS/MS utilizando acetonitrilo como fonte de ionização

 

O Professor J.T. Brenna e colaboradores da Universidade de Cornell desenvolveram uma técnica de espetrometria de massa para localização da posição das duplas ligações dos ácidos gordos sob a forma de ésteres metílicos. A técnica é denominada “covalent adduct chemical ionization tandem mass spectrometry” (CACIMS/MS) e utiliza acetonitrilo como reagente de ionização química. A vantagem desta técnica comparativamente com as já anteriormente descritas, é que não necessita de derivatização química dos ésteres metílicos em outros derivados (ex. DMOX, picolinilo, pirrolidinas) e assim, como não há alteração no tempo de retenção dos ácidos gordos, estes podem ser facilmente comparados com a análise por GLC-FID.

A análise dos ácidos gordos pela técnica de CACIMS/MS assenta em dois passos subsequentes, denominados de CACIMS e CACIMS/MS e representados esquematicamente na Figura 5.

 

figura 5

 

Figura 5 – Representação esquemática da técnica de CACIMS/MS utilizando acetonitrilo como reagente de ionização química. São apresentados dois exemplos dos espectros de massa obtidos do éster metílico 22:5n-3 com duplas ligações nos carbonos-7,10,13,16,19.

 

No primeiro passo o acetonitrilo (CH3CN, m/z 41) sob condições de CI reage consigo próprio produzindo um ião reagente de m/z 54 (CH2=C=N+=CH2). Este ião vai-se ligar covalentemente às duplas ligações dos ácidos gordos originando iões com mais 54 unidades de massa do que o ião molecular, referido como o ião [M+54]+. Para além deste, os espectros de massa de CACIMS originam mais 4 fragmentos característicos e apresentados na Figura 5. Estes produtos correspondem ao ião molecular protonado ([MH]+), à perda de metanol a partir do ião molecular protonado ([MH-32] +) e do fragmento ([M+54-32]+).

Os espetros de massa de CACI para além de nos darem informação sobre o tamanho da cadeia alifática e número de duplas ligações, podem também dar indicação se os ácidos gordos possuem estruturas conjugadas (Michaud et al., 2003; Lawrence e Brenna, 2006). A razão dos iões [M+54]+/[M+54-32]+ nos espetros de CACIMS de ácidos gordos conjugados ou parcialmente conjugados é bastante inferior comparada com a razão nos ácidos gordos com estruturas não conjugadas, ou seja, de ácidos gordos com grupos metileno interrompidos entre duplas ligações. Estes rácios permitiram já diferenciar isómeros conjugados do ácido linoleico (CLA) (Michaud et al., 2003), isómeros 18:3 conjugados (Lawrence e Brenna, 2006) e isómeros parcialmente conjugados do 22:6n-3 (DHA) (Alves et al, 2011).

No entanto, os espectros de CACIMS não nos dão informação sobre a posição das duplas ligações nos ácidos gordos, no entanto os produtos resultantes da dissociação colisional dos iões [M+54]+ durante o 2º passo da técnica de CACIMS/MS, pode formar iões característicos que permitem localizar a posição das duplas ligações. Assim, sob condições de CACIMS/MS são produzidos iões diagnósticos característicos da posição das duplas ligações na cadeia carbonada dos ácidos gordos conjugados ou metileno interrompidos. Os iões diagnósticos correspondem, ao ião ω (fragmento contendo a extremidade da cadeia carbonada do ácido gordo), e o ião α (fragmento contendo o grupo carboxilo). A Tabela 3 resume as fragmentações características para os ácidos gordos conjugados e metileno-interrompidos.

 

Tabela 3 - Resumo gráfico das fragmentações características do ião [M+54]+ sob condições de CACIMS/MS (adaptado de Van Pelt and Brenna, 1999b).

Tabela 3

 

 

A aplicação da técnica de CACIMS/MS na caracterização de ácidos gordos insaturados em estudos de metabolismo lipídico, tanto quanto sabemos, está limitada a grupo do Prof. Brenna da Univ. de Cornell (EUA) e ao nosso grupo do LMLR do CIISA que iniciou a aplicação desta técnica na ex-EZN em Santarém. A limitação desta técnica está no equipamento de GC-MS necessário, pois nem todos os equipamentos têm a capacidade de realizar ionizações químicas com líquidos.

 

 

Figura 6

 Figura 6 – Espectro de CACIMS/MS, utilizando acetonitrilo como reagente de ionização química, do éster metílico 18:2 cis-12,cis-15. No espetro são identificados os iões diagnósticos que permitiram a localização das duplas ligações. O ião base deriva da perda de metanol do ião inicial [M+54]+.

 

 

O nosso grupo, já demostrou através desta técnica que o principal ácido heptadecenóico em gorduras de ruminantes é o 17:1cis-9 (Alves et al., 2006) ao contrário do que muitas vezes era descrito na literatura. Além disso, dois novos intermediários da biohidrogenação do 18:3n-3, foram também já caracterizados por CACIMS/MS, o 18:2 cis-12,cis-15 cujo espetro de massa é apresentado na Figura 6 e que levou à sua identificação pela primeira vez em carne de borrego (Alves e Bessa, 2007) e o 18:3 cis-9,trans-11,trans-15 (Gomez-Cortes et al., de 2009), em leite de ovelha de animais alimentados com dietas suplementados com óleo de linhaça. Deste modo, a técnica de CACIMS/MS é uma boa ferramenta para caracterizar ácidos gordos insaturados, principalmente de intermediários biohidrogenação.

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS                                                            (voltar ao inicio)

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